如何确定光谱信号就是所标记探针的信号

　　荧光成像已经被用到基因、细胞和活体的研究中来，而在活体情况下所面临的挑战最多。

　　1.自发荧光的可变性。a在不同激发光条件下，自发荧光会有明显不同；b动物身体的不同部位会有不同的自发荧光；c同一只动物在不同时间自发荧光的波谱和强度也可以不同；d不同小鼠的自发荧光在波谱和强度上也有差别；e有时会受到饲料的影响。

　　2.所用探针的发射波长较长。用于基因和细胞水平荧光探针或荧光蛋白发射波长通常在600nm以下，而活体研究最佳的发射波长范围在600-900nm之间。

　　3.受探针浓度的影响。荧光探针通常通过尾静脉打入体内，探针会被动物的血液和组织稀释，如果没有明显的靶向，在活体内信号会比较弱，因此探针的靶向性一定要明确，如果没有靶向性，在活体条件下寻找探针的特征光谱会非常难。

　　4.受位置的影响。如果探针靶向的部位距体表较远，一方面激发光的射入会减少，同时发射光也会被组织吸收，位置越深，减少越多。因此如果靶向的部位较深，一定要保证探针的浓度使发光足够强，同时尽量选用发射波长较长的探针。

　　5.合成的探针在活体条件下容易发生变化。用化学或生物的方法合成探针通常在较纯的溶剂中发生反应，但是活体条件下，动物的血液、组织液成分复杂，亲水或疏水性质难以预测，网状内皮系统大量存在，在体外表现很好的探针也有可能在体内发生复杂的变化，导致探针发生结构改变或脱落，从而发射波谱也会发生未知的改变。

　　活体荧光成像面临着多方面的挑战，如何才能做到准确无误的寻找到所要的波谱，进而进行合适的光谱分离呢？以下是一些做体内荧光成像的一些建议：

　　1.探针体外表现稳定可靠。探针合成之后必须要在打入体内之前进行成像，确定发射波谱和强度，需要考察不同批次探针之间是否存在差异，是否有淬灭现象，如果可能的话，用血液等生物体液溶解探针观察是否存在变化。另外在体外观察探针时，也一定要用溶剂做对照。

　　2.要确定靶向性。也就是说要有阳性对照，比如说要做肿瘤的早期诊断，尽量参考前人研究先用确定能够靶向的分子作为阳性对照，这样打入体内后，确定能够在肿瘤位置找到探针的波谱，如此确定之后，找到适合体内光谱分离的拆分条件，用于之后的进一步实验。

　　3.活体成像时一定要有对照。也就是说有阴性对照组，比如通过阳性对照组确定波谱之后，以此光谱分离的拆分条件对阴性对照组进行拆分，如果条件合适的话，阴性对照组应该是没有相应信号的。如此，再比较拆分条件中探针的发射波长和体外观察时的发射波长，如果两者比较接近，那么就能够肯定所寻找的探针波谱就是所考察的信号。

　　4.通过已有知识和时间变化来确定。如果已知所考察探针是亲肝的或亲肾的，在活体内在肝或肾的部位出现信号的聚集，那么此处的信号可能会是所考察探针的信号，另外根据信号随时间的变化来确定是不是所要的信号，比如肿瘤部位的某种信号在注射探针后有明显的随时间的上升后下降的过程，这种现象也提示这个信号就是所考察探针的信号。

　　5.实验初期，尽量选用较高浓度或发光强度的探针。新合成的探针一般会首先观察它的靶向性和体内代谢情况，这时尽量选用最大的剂量或浓度，在动物生命体征不受影响的情况下，越多含量的探针对于体内观察越有利。在对考察探针体内靶向及代谢情况比较了解之后再考虑减少含量，达到最优的生物学效果。

　　通过以上建议，可以归纳为如下流程图：